一文了解微生物检验基础知识

　　微生物检验广泛应用于临床诊断、环境卫生监测、食品卫生检测等领域，而应用最多的是细菌培养。下面，本文详尽阐述细菌培养中最基础的两个环节。

　　一、接种

　　把微生物从原始样本中移植到适宜的培养系统中，这个操作即为“接种”。接种操作是整个微生物检测流程的起点。常用的接种用具包括接种环和接种针，常见的接种方式如下：

　　(一)划线接种

　　这是最基础、最常用的固体培养基的接种方式，从涂布的样本或菌落中引出一条线，在固态介质上按设定方式(如四区法)进行划线，分离出单一菌落。

　　(二)三点接种

　　这种方法经常用于观察真菌的生长特性和菌落形态，用刮刀或接种针将样本或菌落嵌入在真菌培养基中，点三处排成一个等边的三角形，可观察真菌生长的速度、形态差异、产生色素等特征。

　　(三)穿刺接种

　　该法多用于对厌氧菌的保存或研究。使用接种针将微生物沿着一条线穿刺到半固体培养基的中央。经培养后，可观察其在接种线周围的扩散形态，判断是否具备运动性或厌氧生长。如果一株细菌会移动，就会围绕着这条线生长。

　　(四)倾注平板接种

　　这种方法是先往空培养皿中倾注一定量的菌液或液态的样本，然后再加入高温灭菌后又降温到45℃的液体培养基，快速轻晃混匀，培养基凝固后，放入培养箱中培养。该方法培养出单个菌落清晰可见，常用于菌落计数。

　　(五)涂布接种

　　涂布接种是一种常用无菌玻璃涂布棒，将少量(约0.2毫升)稀释的菌液在琼脂表面均匀铺开，培养后获得定量菌落计数的计数技术。如条件允许，可将平皿置于旋转的涂布台上进行涂布。

　　(六)液体接种

　　该法适用于需在液体培养基中扩增微生物或研究其代谢产物的实验，例如发酵、酶产生、代谢途径研究等。接种方式可通过移液管、吸管、注射器或环完成。

　　(七)活体接种

　　该方法多用于动物模型构建和疫苗效力评估，将病原菌接种到实验动物或细胞培养系统中，用于模拟自然感染过程，研究病理反应、免疫应答或药物疗效。例如鼠伤寒沙门氏菌模型常用于小鼠体内感染实验。这种技术是通过注射器注入的方式，把菌液注入到实验动物或细胞中。

　　(八)注射接种

　　这种技术是通过注入的方式，把要连接的微生物转移到人类或者其他动物的体内，而最常用的是通过注射的方式将微生物注入到体内，从而防止一些疾病的发生。

　　二、鉴定

　　(一)生化实验

　　生化实验是最早应用于细菌鉴定的方法，也是一种经典方法。不同的细菌因遗传基因有所差异，编码的酶系统及代谢途径具有特异性，可通过构建特征性生化反应谱，建立系统化的菌种鉴别体系来鉴定细菌菌种。例如，乳糖发酵试验中，产气荚膜梭菌会产生大量气体，冲破凡士林封层；硫化氢试验里，沙门氏菌会把培养基染成金属光泽的黑色。

　　(二)质谱鉴定

　　细菌的核糖体蛋白具有种属特异性强、表达量稳定、电离效率高等特性，这些蛋白在质荷比(m/z)2000~20000范围内形成特征峰谱，构成微生物的“蛋白质条形码”。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪通过发射激光脉冲，使细菌的蛋白质分子电离进入飞行管，检测器记录特征峰谱，通过和数据库的比对，判定出细菌的种类。

　　(三)PCR技术

　　聚合酶链式反应(PCR)是一种基于DNA体外扩增的分子生物学技术，其通过特异性引物引导、耐高温DNA聚合酶催化，实现将目标DNA片段完成指数级复制。在微生物鉴定领域，PCR技术通过靶向物种保守或特征性基因区域，将微量微生物核酸信号放大至可检测水平，从而突破传统培养法的灵敏度限制，成为病原体快速检测的核心技术。

　　(四)宏基因组测序

　　宏基因组测序(mNGS)是一种高通量测序技术，能够不经过培养，直接对样本中的微生物进行基因组学分析。其原理是通过提取样本中的全部DNA或RNA，获取样本中所有微生物基因组的序列数据，应用生物信息学分析方法与数据库中的序列进行比对，识别其中的微生物种类及其丰度。与传统的微生物检验方法(如培养、PCR等)相比，mNGS可以一次性检测到样本中的所有微生物，包括常见和罕见的病原体，解决“不可培养的微生物”难题，彻底改变了人类认识微生物世界的方式。

　　龙丽娜 贺州市人民医院